发布日期：2024-12-12 21:31 点击次数：133
鲁氏耶尔森氏菌Yersinia ruckeri属于肠杆菌科Enterobacteriaceae耶尔森氏菌属Yersinia，是鲑鳟鱼类的贫乏病原菌，其感染引起鲑鳟鱼的肠炎红嘴病(Enteric redmouth，ERM)，主要病变特质为体表(尤其是嘴、鳍、泄殖孔)及内脏器官充血、出血等[1]。此外，该细菌还可感染鲢Hypophthalmichthys molitrix、鳙Aristichthys nobilis[2]、金鱼Carassius auratus、鲟鱼Acipenser sturio[3]、鲤鱼Cyprinus carpio、黑点叉尾鮰Ietalurus punetaus[4]等鱼类萝莉 porn，引起败血症[5]。自1952年在好意思国初次从发病的虹鳟Oncorhynchus mykiss等分离到鲁氏耶尔森氏菌以来[6]，接踵在德国、法国、英国等欧洲列国，以及澳大利亚、中国均有所发现[7]，其地舆散播渐渐扩大，危害的鱼类种类也不休加多，供水产衍生变成了较为严重的胁迫。
鲟鱼(Sturgeon)是地球上最陈旧的鱼种之一[8]，因其具有极高的养分价值而成为一种贫乏的经济鱼类。我国自1992年引进该品种，现已实践到除西藏之外整个省市，至2015年，我国鲟鱼衍分娩量已达90 828 t，成为环球最大的养鲟国度。但跟着衍生集约化过程栽植，衍生水体的内、外源沾污加剧，各式疾病频发，如维氏气单胞菌Aeromonas veronii[9]、嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila[10]、海豚链球菌Streptococcus iniae[11]等细菌性疾病时有报说念，给我国鲟鱼衍生业变成严重亏欠。2016年4月四川省邛崃市某鲟鱼衍生场暴发一种以口腔周围出血，肛门红肿、外突和内脏器官不同过程出血为临床特征的传染病，物化率达40%，发病水温16~20 ℃，发病鱼体质地100 g傍边。本连络对病鱼进行病原菌镜检、分离、纯化及毅然，同期进行了药敏熟习、东说念主工感染熟习及病理损害不雅察，旨在为该病的会诊与防治提供依据与参考。
探花巨乳 1 材料与行动 1.1 熟习动物与试剂发病杂交鲟Acipenser schrencki ♀×A. baeri♂采自四川省邛崃市某衍生场，体质地(102.7±8.5) g，健康杂交鲟体质地(124.5±10.3) g，购于彭州市某衍生场。
LB浸液培养基(北京欣经科生物工夫有限公司)、细菌DNA索要试剂盒、DNA Marker和卵白酶K[天根生化科技(北京)有限公司]、药敏试纸及细菌生化微量毅然管(杭州微生物试剂有限公司)。
1.2 病原菌镜检与分离纯化取10尾濒死杂交鲟的鳃丝、消化说念内含物、体表附着物便是载玻片上，进行寄生虫压片镜检；取肝、脾、肾等组织于载玻片上涂片，革兰氏染色后油镜查验细菌；无菌条目下，从病鱼肝、脾、肾取样划线接种于LB平板，28 ℃条目下恒温培养24~48 h，挑取形态大小一致的单个上风菌落在LB平板上，再次划线培养，获取纯培养菌株，不雅察菌落与细菌形态特征，–80 ℃条目下保存备用。
1.3 东说念主工感染熟习分离菌在LB平板上28 ℃条目下培养24 h，无菌生理盐水洗下菌苔，麦氏比浊法颐养菌悬液浓度为2.8×105、2.8×106、2.8×107和2.8×108 cfu·mL–1，健康杂交鲟实验室暂养7 d后，每尾腹腔打针0.3 mL菌液，每组10尾，对照组打针等量生理盐水。接种后不雅察鱼的临床症状及物化情况，贯穿不雅察14 d，并对物化鱼实时剖检，且再次分离毅然致病菌。
1.4 分离菌理化性情及药敏熟习无菌挑取上述纯培养菌液于微量生化反映管，28 ℃条目下培养24 h，各式理化倡导参照文件[12]进行测定。药敏熟习汲取圭臬Kriby-Bauer纸片扩散法，参照NCCLS抗微生物药物敏锐性熟习施行圭臬[13]进行。
1.5 分离菌gyrB基因与16S rRNA基因PCR扩增与测序分析将纯化菌株接种至LB肉汤中，28 ℃条目下培养24 h，使用细菌DNA索要试剂盒索要分离菌株的DNA手脚模板，差别进行gyrB基因和16S rRNA基因的PCR扩增。gyrB基因扩增引物(F:5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCA(TC)GC(TCAG)GG(TCAG)GG(TCAG)AA(AG)TT(TC)GA-3′；R:5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCC(AG) TC(TCAG)AC(AG)TC(TCAG)GC(AG)TC(TCAG)GTCAT-3′)[14]，预期扩增片断大小约为1 200 bp；16S rRNA基因扩增引物(F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3′)[15]，预期扩增片断大小约为1 500 bp。PCR反映体系：PCR Master Mix(2x)12.5 μL、10 μmol·L–1的险峻游引物各1 μL，2 μL模板DNA，加ddH2O至25 μL。PCR反映面容：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃蔓延1 min 45 s，共30个轮回；终末，72 ℃蔓延5 min。PCR扩增居品经10 g·L–1的琼脂糖凝胶电泳检测。PCR居品经DNA纯化试剂盒纯化后，送成都擎科梓熙生物工夫有限公司测序。
1.6 组织病理学不雅察取患病鱼心、肝、脾、肾、鳃、肠和肌肉等组织，用体积分数为10%的中性甲醛溶液固定，石蜡包埋，老例切片，苏木精–伊红染色(HE染色)，中性树胶封片，光学显微镜下不雅察并摄影记载。
2 后果与分析 2.1 临床症状与剖检病鱼临床症状推崇为体色变暗，食欲着落或丧失，嘴部红肿、出血(图1A)，肛门红肿，外突；剖检见肝肿大，色白质脆，名义黑点状出血；肠壁变薄(图1B)，肠腔内莫得食品，充满多半淡黄色黏液；肾、脾肿大；鳃肿胀，黏液分泌加多，以致发生坏死；部分病鱼腹腔内见一定量淡黄色腹水(图1C)。
2.2 病原菌分离与镜检鳃与内脏压片镜检未不雅察到寄生虫；内脏器官涂片，革兰氏染色镜检见组织内有单个或成对摆设的革兰阴性短杆菌。无菌条目下从肝、肾、脾取样，划线接种于LB平板，28 ℃条目下培养24 h，获取名义光滑、凸起、边际整都、直径约为2 mm的乳白色圆形小菌落的上风菌(图2A)，革兰氏染色光辉学显微镜下不雅察分离菌为G–短杆菌，单个摆设(图2B)。
2.3 东说念主工感染熟习分离菌腹腔打针感染健康杂交鲟，攻毒12 h后，熟习鱼酣畅，反映鲁钝；2.8×108 cfu·mL–1浓度组在24 h后驱动出现物化，2.8×107、2.8×106与2.8×105 cfu·mL–1浓度组接踵在32 h后驱动物化；发病鱼的临床推崇和病理变化与当然发病鱼一样，感染5 d后各熟习组鱼未再发生物化；而对照组无任何相称，各组的物化情况见表1。汲取寇氏法得出分离菌对杂交鲟的半数致死量(LD50)为5.3×106 cfu·尾–1。从东说念主工感染发病物化的鱼体内再次分离细菌，获取与分离株形态、生化性情一致的细菌。
表 1 菌株YC160412东说念主工感染杂交鲟的熟习后果
Table 1 Experimental results of hybrid sturgeon artificially infected by strain YC160412
2.4 理化性情后果
老例理化分析标明，分离菌株YC160412为革兰氏染色阴性，最适滋长温度为22~28 ℃，最适pH为7.0，氧化酶反映阴性，氧化发酵阳性，具有畅通性，其他生化性情见表2。
表 2 菌株YC160412与鲁氏耶尔森氏菌的理化性情比拟1)
Table 2 Comparisons of physicochemical characteristics of strain YC160412 with Yersinia ruckeri
2.5 gyrB基因、16S rRNA基因序列测定及系统发育分析
以分离菌株的DNA为模板，差别扩增的gyrB和16S rRNA基因条带均与预期相符，测序后果在GenBank(gyrB基因的序列登录号为MG017541，16S rRNA基因的序列登录号为KY848832)进行Blast分析，后果显现序列与Y. ruckeri的gyrB和16S rRNA基因一样性最高，差别为99.0%和99.8%。进一步运用MEGA 5.02软件对分离菌株的16S rRNA和gyrB基因序列构建系统发育树(图3，图4)，在系统发育树上分离株YC160412与Y. ruckeri均聚为合并个分支。
2.6 药敏熟习对菌株YC160412进行23种抗生素药物的敏锐性熟习，后果显现，该分离株冤家孢噻肟、头孢唑啉、氨苄西林、氧氟沙星、大不雅霉素和氟苯尼考等抗生素高度敏锐，对阿莫西林、林可霉素、克林霉素、红霉素、青霉素等耐药，对四环素和新霉素推崇为中度敏锐，具体见表3。
表 3 菌株YC160412抗生素药敏熟习后果
Table 3 Antibiotic susceptibility test results of strain YC160412
2.7 组织病理不雅察
通过剖解及光学显微镜对患病鱼的心、肝、脾、肾、鳃、肠和肌肉等组织切片进行不雅察，后果发现：病鱼心外膜与心包膜水肿增厚，心包腔内多半淋巴细胞浸润(图5A)；心肌纤维颗粒变性或空泡变性，以致发生断裂、溶化，其间有小数淋巴细胞浸润(图5B)；肝血窦淤血，肝细胞肿胀，出现平时性空泡变性(图5C)，严重的发生坏死，并在肝组织内见杆状的细菌团块(图5D)；脾髓窦淤血、出血，淋巴细胞坏死，数目明显减少，巨噬细胞、中性白细胞浸润，网状内皮细胞增生(图5E)，并在一些坏死区可见细菌团块(图5F)；肾小管发生颗粒变性、坏死，肾小球毛细血管彭胀，充血，肾小囊内可见多半染成淡红色的渗出物，肾间造血组织细胞坏死，细胞核裂解，中性粒细胞、嗜酸性粒细胞与巨噬细胞等炎症细胞浸润(图5G)，同期在一些坏死区域可见细菌团块(图5H)；肠绒毛上皮变性、坏死，衰退的上皮细胞与黏液充滞肠腔内，固有膜与黏膜基层淋巴细胞、中性粒细胞与巨噬细胞等炎症细胞浸润(图5I)。
3 商讨与论断自1952岁首次从发病虹鳟等分离Y．ruckeri以来，其感染所致的“肠炎红嘴病”一直被合计是危害鲑鳟鱼类衍生的疾病，但也接踵有鲢[2]、金鱼、施氏鲟Acipenser schrenckii[16]、鲤和黑点叉尾鮰[4]等鱼类感染引起败血症的报说念[5]，标明其感染的宿主限制在冉冉扩大。本连络从发生肠炎与口唇红肿的杂交鲟体内分离到1株革兰阴性细菌，经东说念主工感染熟习证据了其病原性，证据分离细菌的形态学特征和生理生化性情初步笃定为Y．ruckeri；基于其16S rRNA和gyrB基因序列的系统发育分析标明，其与Y．ruckeri进化关系密切，一样性达到99%以上，聚积形态学和理化特征毅然该菌为Y．ruckeri。杂交鲟在感染Y．ruckeri后推崇出了虹鳟、黑点叉尾鮰等一样的临床推崇，即肠炎与口唇充血、出血而发红，由此可见，该临床特征可手脚临床上初步会诊该病的贫乏依据。但本连络也发现，有部分感染杂交鲟未出现明显的临床病变、物化，因此，临床上对该病的真正会诊还需要借助于PCR与Elisa等特异性更强的行动。
本连络中，鲟鱼感染Y．ruckeri后主要推崇为全身性多组织器官坏死、变性、出血等败血症，与Y．ruckeri感染其他宿主所引起的临床症状不尽相通，该菌感染虹鳟时推崇为腹黑充血、出血，细胞肿胀；肝脂肪变性，血窦覆没；肾小管无明显病变，肾小球系膜细胞增生，淋巴细胞显耀减少，单核细胞增生[17]。但本连络发现，杂交鲟感染Y. ruckeri后，其肝脏、肾脏的损害尤其明显，肝血窦淤血，细胞肿胀，出现平时性空泡变性，以致发生坏死；肾小管发生颗粒变性、坏死，肾小囊内有多半渗出液，肾间造血组织坏死，多半炎症细胞浸润，出现这种各别的原因可能与感染宿主的种属各别以及与病原的互作效应不同关连。另外，本连络发当今染病鲟的肝、脾和肾组织中存在多半细菌团块，标明这些器官可能是Y．ruckeri感染鲟的主要亲嗜器官。
药敏熟习后果标明，该菌冤家孢噻肟、头孢唑啉、氨苄西林、氧氟沙星、大不雅霉素和氟苯尼考等抗生素敏锐，对阿莫西林、林可霉素、克林霉素、红霉素等耐药，且骨子惩办中汲取敏锐药物氟苯尼考内服较为灵验地截至了疫情。分离菌的药物敏锐性与杨移斌等[18]及王荻等[19]报说念从西伯利亚鲟分离到Y．ruckeri对丁胺卡那、庆大霉素、氟苯尼考敏锐，对克林霉素耐药具有一样性；但与范方玲等[20]报说念从黑点叉尾鮰分离到的Y．ruckeri对环丙沙星、卡那霉素等药物敏锐性情存在各别。由此可见，着手于不同动物源或区域的同种细菌，在药物敏锐性上可能存在各别。因此，为幸免药物花费，在鱼类细菌性疾病的诊疗中应证据药敏熟习后果采纳敏锐抗菌药物萝莉 porn，本熟习后果可为率领衍生分娩中杂交鲟鲁氏耶尔森氏菌病的灵验诊疗及安全用药提供一定的参考。
